结核分枝杆菌Mtb8.4DNA疫苗构建及免疫保护研究
作者：佚名； 更新时间：2014-12-13
关键词：结核分枝杆菌;DNA疫苗;分泌蛋白;细胞免疫;免疫保护
摘要:目的 评价构建结核菌DNA疫苗pVS84免疫小鼠体外产生细胞因子的能力和抵抗结核分枝杆菌H37Rv攻击的效果。 方法 利用基因技术将结核菌Mtb8.4插入pVAXl载体，构建表达结核菌Mtb8.4蛋白（分泌型）的DNA疫苗pVS84。将雌性C57BL/6小鼠分成5组，每组20只，分别用pVS84、pVAXl、plL2S和PBS分别各免疫3次，每次均间隔2周，以等剂量加强免疫2次。另一组用BCG（10 5 CFU）皮内注射免疫1次。每组10只鼠在最后一次加强免疫后，无菌取脾培养，检测上清细胞因子。另10只鼠则用结核菌H37Rv经静脉攻击，2周后取脾、肝和肺培养结核菌并进行菌落计数。 结果 pVS84免疫组鼠脾淋巴细胞培养上清的mIL-2和mlFN-Y平均含量分别为（290.0±112.9）pg/ml和（501.7±79.4）pg/ml，信捷职称论文写作发表网，显著高于3个阴性对照组（P<0.001），与BCG免疫组无显著性差异（P>0.05）。5个组的平均mIL-6和mIL-10无显著性差异。pVS84免疫组小鼠的脾、肝和肺的平均结核菌载量分别为（39176.9±3702.6）、（18780.1±2535.8）和（24410.3±1846.8）CFU/g，分别低于pVAXl、plL2S和PBS三个阴性对照组的相应器官的结核菌载量（P<0.001），仅脾结核菌载量显著高于BCG免疫对照组。 结论 构建的DNA疫苗pVS84能够刺激机体产生抗结核菌所需的Thl型免疫应答，免疫鼠抵抗H37Rv攻击的能力与BCG接近。
关键词:结核分枝杆菌;DNA疫苗;分泌蛋白;细胞免疫;免疫保护
Construction and protective efficacy of the TB DNA vaccine expressing Mycobacterium tuberculosis secretory Mtb8.4protein.
Abstract:Objective To evaluate the capacity in production of cytokines in vitro and the protective efficacy of the mice immu-nized with the TB DNA vaccine pVS84we constructed. Methods Plasmid pVS84expressing secretory protein of Mycobacterium tuberculosisMtb8.4was constructed by inserting mtb8.4into the vector pVAX1.20female C57BL/6inbred mice in5groups immu-nized with the100ug pVS84，pIL2S，pVAX1，PBS and BCG（105CFU）for3times with2weeks intervals except BCG（only one vac-cinization without boost）.Sera and supernatants of10mice in each group were determined for hIL-2，mIL-2，mIFN-γ，mIL-6and mIL-10by sandwich ELISA.The other10mice in each group were challenged with10 6 CFUs MtuberculosisH37Rv and killed for culturing H37Rv from the spleens，lungs and livers. Results The average concentrations of mIL-2and mIFN-γin the supe-matants from pVS84immunized mice were290.0+112.9pg/mL and501.7+79.4pg/mL respectively，significantly higher than those from the pVAX1，pIL2S，and PBS injected controls（P<0.001）.No significantly difference has been observed for the miL-6and miL-10concentrations from the mice in all5groups.The average Mtuberculosis loads in the spleens，livers and lungs in the pVS84immunized group were39176.9±3702.6CFU/g，18780.1±2535.8CFU/g and24410.3±1846.8CFU/g respectively.The average bacterial loads of the3organs in the pVS84immunized group were significantly lower than those of their counterparts in pVAX1，pIL2S and PBS injected groups，but bacterial load in the spleens was significantly higher than that of their counterparts in the BCG immunized controls. Conclusion TB DNA vaccine pVS84we constructed can induce Thl immune response which is neces-sary for prevention against TB，and it can evoke protective immunity to H37Rv challenge in the immunized mice equal to BCG immu-nization.
Key words:Mycobacterium tuberculosis;TB DNA vaccine;CMI;Protective efficacy
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，结核菌）是引起结核病（TB）的病原体，在全球范围内，TB每年引起的病死病例为200万，每年新出现的结核病例高达800万 ［1］ 。AIDS在世界范围内的蔓延和耐药性结核病例和多耐药结核病例的增加，使有效控制TB的工作更加困难。卡介苗（BCG）在预防儿童结核病成效已得到肯定，但预防成人TB则效果不稳定。经严格设计控制的调查结果表明，BCG的保护率在0～80%之间 ［2］ 。为此寻求优效的新型疫苗乃当务之急。不少学者尝试亚单位疫苗和DNA疫苗在结核病的预防工作中发挥更加有效的作用。从目前的结果看，效果仍然欠缺 ［3］ 。本研究利用基因操作技术，将具有免疫保护作用的蛋白Mtb8.4的基因连接、插入美国FDA推荐可用于人体的表达载体pVAXl中，构建表达结核菌保护抗原Mtb8.4的真核表达载体。提取并纯化该质粒后，免疫纯系近交系C57BL/6小鼠，免疫小鼠抵抗经静脉注射结核菌H37Rv攻击的能力显著增强，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 结核菌H37Rv标准株（ATCC27294） 由武汉大学医学院免疫学系刘君炎教授赠送。其毒力通过定期小鼠体内传种维持。细菌的增殖在改良罗氏（Lowenstein-Jensen Medium，L-J）培养基进行。
1.1.2 pVAXl真核表达载体 美国Invitrogen公司产品，由美国国立卫生研究院张颖研究员提供。其基因序列及多克隆位点见该公司网站资料（）。
1.1.3 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）DH5α及JM109株 本院检验科保存菌株。
1.1.4 Ex TaqDNA酶，LA TaqDNA多聚酶，10×PCR缓冲液，dNTPs，限制内切酶KpnⅠ，HindⅢ，BamHⅠ和NheⅠ等购自大连宝生物公司。
1.1.5 PCR试剂等 PCR产物回收试剂盒，DNA连接试剂盒，DNA Marker等购自大连宝生物公司。
1.1.6 BCG 上海生物制品研究所生产。
1.1.7 C57BL/6小鼠 购自北京维通利华实验动物公司。均为雌性，购买时6～8周龄，初次免疫时8-10周龄。动物在实验期间，饲养在无特殊病原体条件。该公司提供的C57BL/6小鼠的核心种群来源于Charles River Laboratories（Wilmington，Mass，USA）。
1.1.8 hlL-2、鼠白细胞介素-2（murine interleukin-2，mIL-2）、鼠白细胞介素-6（mIL-6）、鼠白细胞介素-10（mIL-10）和鼠干扰素γ（murine Interferonγ，mlFN-γ）定量测定试剂盒由法国Diaclone Research公司产品。
1.1.9 胎牛血清（CSF） 购自暨南大学生物技术研究所，为进口分装产品。
1.1.10 RPMI1640培养基 Gibco公司产品。临用前，10ml CSF与90ml RPMI培养液混合即可。
1.1.11 免疫读数仪 芬兰Labsystem公司生产的Wellscan MKⅡ型。
1.2 方法
1.2.1 结核菌基因组DNA的提取 用接种环从L-J斜面上刮取少许H37Rv菌落，放入尖底塑料离心管管 底，加入溶菌酶和蛋白酶K裂解菌体后，苯酚氯仿纯化，无水乙醇沉淀DNA后，加入100μl TE缓冲液溶解备用 ［4］ 。
1.2.2 表达载体的构建过程:见图1。
1）合成引物:hIL-2信号序列DNA片段的制作:hIL2sig-P1:5’-CCG CAT GCT AGC ATG TAC AGG ATG CAA CTC CTG TCT TGC ATT GCA CTA TGT CTT GCA CTT GTC ACA AAC AGT GCA AAG CTT CAG-3’。hIL2sig-P2:3’-GGC GTA CGA TCG TAC ATG TCC TAC GTT GAG GAC AGA ACG TAA CGT GAT TCA GAA CGT GAA CAG TGT TTG TCA CGT TTC GAA GTC-5’。以上两条单链核酸分别为hIL-2信号序列互补的正链和负链，见hIL-2基因:Genbank accession nmber:NM-000586。信号序列（Signal-peptide:295～354位碱基序列，60bp，20aa）;成熟肽链（Mat-peptide:355-753位寡核苷酸链，399bp，133aa） ［6，7］ 。下划线部分分别为NheⅠ和HindⅢ酶切位点。
2）根据DNA序列，合成单链小片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链叫A片段。
3）上述合成的片断经NheⅠ和HindⅢ双切酶，产物通过PCR Fragment Recov
摘要:目的 评价构建结核菌DNA疫苗pVS84免疫小鼠体外产生细胞因子的能力和抵抗结核分枝杆菌H37Rv攻击的效果。 方法 利用基因技术将结核菌Mtb8.4插入pVAXl载体，构建表达结核菌Mtb8.4蛋白（分泌型）的DNA疫苗pVS84。将雌性C57BL/6小鼠分成5组，每组20只，分别用pVS84、pVAXl、plL2S和PBS分别各免疫3次，每次均间隔2周，以等剂量加强免疫2次。另一组用BCG（10 5 CFU）皮内注射免疫1次。每组10只鼠在最后一次加强免疫后，无菌取脾培养，检测上清细胞因子。另10只鼠则用结核菌H37Rv经静脉攻击，2周后取脾、肝和肺培养结核菌并进行菌落计数。 结果 pVS84免疫组鼠脾淋巴细胞培养上清的mIL-2和mlFN-Y平均含量分别为（290.0±112.9）pg/ml和（501.7±79.4）pg/ml，信捷职称论文写作发表网，显著高于3个阴性对照组（P<0.001），与BCG免疫组无显著性差异（P>0.05）。5个组的平均mIL-6和mIL-10无显著性差异。pVS84免疫组小鼠的脾、肝和肺的平均结核菌载量分别为（39176.9±3702.6）、（18780.1±2535.8）和（24410.3±1846.8）CFU/g，分别低于pVAXl、plL2S和PBS三个阴性对照组的相应器官的结核菌载量（P<0.001），仅脾结核菌载量显著高于BCG免疫对照组。 结论 构建的DNA疫苗pVS84能够刺激机体产生抗结核菌所需的Thl型免疫应答，免疫鼠抵抗H37Rv攻击的能力与BCG接近。
关键词:结核分枝杆菌;DNA疫苗;分泌蛋白;细胞免疫;免疫保护
Construction and protective efficacy of the TB DNA vaccine expressing Mycobacterium tuberculosis secretory Mtb8.4protein.
Abstract:Objective To evaluate the capacity in production of cytokines in vitro and the protective efficacy of the mice immu-nized with the TB DNA vaccine pVS84we constructed. Methods Plasmid pVS84expressing secretory protein of Mycobacterium tuberculosisMtb8.4was constructed by inserting mtb8.4into the vector pVAX1.20female C57BL/6inbred mice in5groups immu-nized with the100ug pVS84，pIL2S，pVAX1，PBS and BCG（105CFU）for3times with2weeks intervals except BCG（only one vac-cinization without boost）.Sera and supernatants of10mice in each group were determined for hIL-2，mIL-2，mIFN-γ，mIL-6and mIL-10by sandwich ELISA.The other10mice in each group were challenged with10 6 CFUs MtuberculosisH37Rv and killed for culturing H37Rv from the spleens，lungs and livers. Results The average concentrations of mIL-2and mIFN-γin the supe-matants from pVS84immunized mice were290.0+112.9pg/mL and501.7+79.4pg/mL respectively，significantly higher than those from the pVAX1，pIL2S，and PBS injected controls（P<0.001）.No significantly difference has been observed for the miL-6and miL-10concentrations from the mice in all5groups.The average Mtuberculosis loads in the spleens，livers and lungs in the pVS84immunized group were39176.9±3702.6CFU/g，18780.1±2535.8CFU/g and24410.3±1846.8CFU/g respectively.The average bacterial loads of the3organs in the pVS84immunized group were significantly lower than those of their counterparts in pVAX1，pIL2S and PBS injected groups，but bacterial load in the spleens was significantly higher than that of their counterparts in the BCG immunized controls. Conclusion TB DNA vaccine pVS84we constructed can induce Thl immune response which is neces-sary for prevention against TB，and it can evoke protective immunity to H37Rv challenge in the immunized mice equal to BCG immu-nization.
Key words:Mycobacterium tuberculosis;TB DNA vaccine;CMI;Protective efficacy
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，结核菌）是引起结核病（TB）的病原体，在全球范围内，TB每年引起的病死病例为200万，每年新出现的结核病例高达800万 ［1］ 。AIDS在世界范围内的蔓延和耐药性结核病例和多耐药结核病例的增加，使有效控制TB的工作更加困难。卡介苗（BCG）在预防儿童结核病成效已得到肯定，但预防成人TB则效果不稳定。经严格设计控制的调查结果表明，BCG的保护率在0～80%之间 ［2］ 。为此寻求优效的新型疫苗乃当务之急。不少学者尝试亚单位疫苗和DNA疫苗在结核病的预防工作中发挥更加有效的作用。从目前的结果看，效果仍然欠缺 ［3］ 。本研究利用基因操作技术，将具有免疫保护作用的蛋白Mtb8.4的基因连接、插入美国FDA推荐可用于人体的表达载体pVAXl中，构建表达结核菌保护抗原Mtb8.4的真核表达载体。提取并纯化该质粒后，免疫纯系近交系C57BL/6小鼠，免疫小鼠抵抗经静脉注射结核菌H37Rv攻击的能力显著增强，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 结核菌H37Rv标准株（ATCC27294） 由武汉大学医学院免疫学系刘君炎教授赠送。其毒力通过定期小鼠体内传种维持。细菌的增殖在改良罗氏（Lowenstein-Jensen Medium，L-J）培养基进行。
1.1.2 pVAXl真核表达载体 美国Invitrogen公司产品，由美国国立卫生研究院张颖研究员提供。其基因序列及多克隆位点见该公司网站资料（）。
1.1.3 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）DH5α及JM109株 本院检验科保存菌株。
1.1.4 Ex TaqDNA酶，LA TaqDNA多聚酶，10×PCR缓冲液，dNTPs，限制内切酶KpnⅠ，HindⅢ，BamHⅠ和NheⅠ等购自大连宝生物公司。
1.1.5 PCR试剂等 PCR产物回收试剂盒，DNA连接试剂盒，DNA Marker等购自大连宝生物公司。
1.1.6 BCG 上海生物制品研究所生产。
1.1.7 C57BL/6小鼠 购自北京维通利华实验动物公司。均为雌性，购买时6～8周龄，初次免疫时8-10周龄。动物在实验期间，饲养在无特殊病原体条件。该公司提供的C57BL/6小鼠的核心种群来源于Charles River Laboratories（Wilmington，Mass，USA）。
1.1.8 hlL-2、鼠白细胞介素-2（murine interleukin-2，mIL-2）、鼠白细胞介素-6（mIL-6）、鼠白细胞介素-10（mIL-10）和鼠干扰素γ（murine Interferonγ，mlFN-γ）定量测定试剂盒由法国Diaclone Research公司产品。
1.1.9 胎牛血清（CSF） 购自暨南大学生物技术研究所，为进口分装产品。
1.1.10 RPMI1640培养基 Gibco公司产品。临用前，10ml CSF与90ml RPMI培养液混合即可。
1.1.11 免疫读数仪 芬兰Labsystem公司生产的Wellscan MKⅡ型。
1.2 方法
1.2.1 结核菌基因组DNA的提取 用接种环从L-J斜面上刮取少许H37Rv菌落，放入尖底塑料离心管管 底，加入溶菌酶和蛋白酶K裂解菌体后，苯酚氯仿纯化，无水乙醇沉淀DNA后，加入100μl TE缓冲液溶解备用 ［4］ 。
1.2.2 表达载体的构建过程:见图1。
1）合成引物:hIL-2信号序列DNA片段的制作:hIL2sig-P1:5’-CCG CAT GCT AGC ATG TAC AGG ATG CAA CTC CTG TCT TGC ATT GCA CTA TGT CTT GCA CTT GTC ACA AAC AGT GCA AAG CTT CAG-3’。hIL2sig-P2:3’-GGC GTA CGA TCG TAC ATG TCC TAC GTT GAG GAC AGA ACG TAA CGT GAT TCA GAA CGT GAA CAG TGT TTG TCA CGT TTC GAA GTC-5’。以上两条单链核酸分别为hIL-2信号序列互补的正链和负链，见hIL-2基因:Genbank accession nmber:NM-000586。信号序列（Signal-peptide:295～354位碱基序列，60bp，20aa）;成熟肽链（Mat-peptide:355-753位寡核苷酸链，399bp，133aa） ［6，7］ 。下划线部分分别为NheⅠ和HindⅢ酶切位点。
2）根据DNA序列，合成单链小片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链叫A片段。
3）上述合成的片断经NheⅠ和HindⅢ双切酶，产物通过PCR Fragment Recov
