【关键词】  受体;,肾上腺素能β3;,载体

　　β3AR gene cloning from human bladder detrusor smooth muscle and construction of its antisense eukaryotic expression vector

　　【Abstract】 AIM: To clone human beta3 adrenoceptor (β3AR) gene from human bladder detrusor smooth muscle and construct its antisense eukaryotic expression vector. METHODS: The β3AR fulllength cDNA was cloned and amplified from human detrusor muscle cells through RTPCR (BamHI and ClaI sites were added into the 5′ end of upstream primer, and HindIII into downstream) and subcloned into clone vector (pUC18). The target gene was then cut from ClaI/HindIII sites of pUC18 with restriction endonuclease and inserted inversely into pLNCX vector. Finally, the constructed β3AR gene antisense expression vector was identified though restriction endonuclease analysis and sequencing. RESULTS: Target gene of about 1.2 kb was successfully cloned into retroviral vector pLNCX. The sequence of cloned β3AR fulllength cDNA was identical to the reported one in GenBank. The constructed antisense eukaryotic expression vector was proved the same as designed by restriction endonuclease analysis and sequencing.  CONCLUSION: β3AR fulllength cDNA was cloned from human bladder smooth muscle and their antisense eukaryotic expression vectors were constructed successfully.

　　【Keywords】 receptors; adrenergic β3; vector

　　【摘要】 目的: 克隆人膀胱逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因全长，并构建其反义真核表达载体. 方法:采用RTPCR法从人膀胱逼尿肌中扩增出β3AR的全长cDNA序列，上游引物5′端加有BamHI及ClaI酶切位点，下游引物加有HindIII酶切位点，将该片段插入pUC18载体中，摇菌扩增后，用ClaI和HindIII切下目的基因，然后将目的片段反向插入逆转录病毒表达载体pLNCX上. 最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定. 结果：经琼脂糖凝胶鉴定，所克隆的目的基因大约为1.2 kb，并成功地连接到逆转录病毒载体pLNCX上，经测序证明，插入的目的片段其碱基序列与Genbank上报道的完全一致，且插入载体的方向完全正确. 结论：成功克隆了人逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因的全长cDNA序列和构建了其反义真核表达载体.

　　【关键词】 受体; 肾上腺素能β3; 载体

　　0引言

　　膀胱逼尿肌活动亢进是下尿路症状的常见原因. 研究发现，肾上腺素能β受体（βadrenoceptor, βAR）亚型能够介导膀胱平滑肌松弛，对维持储尿过程中膀胱良好的顺应性起着关键作用［1］. 但何种βAR亚型介导逼尿肌松弛，国内外学者还有一定的争论［2-3］. 为进一步探讨βAR亚型在逼尿肌中功能奠定基础，我们拟采用反义基因（antisense）技术，构建βAR亚型的反义真核表达载体，封闭三种βAR中的任意两个，得到表达单一亚型的细胞克隆，再进一步进行研究，以确定βAR激活对逼尿肌细胞的松弛和增殖的影响，并为寻找新的最终解决膀胱逼尿肌活动亢进的治疗方法提供理论依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料人膀胱逼尿肌标本取自手术中因膀胱癌而行膀胱全切患者标本，取正常组织的膀胱平滑肌约1 g，迅速放入液氮中10 min，再放入-70℃冰箱中保存. pUC19购于Takara公司；逆转录病毒载体plncx购自Invitrogen公司；JM109大肠杆菌感受态菌株购自Takara公司. 限制性内切酶和DNA工具酶BamHI，HindIII，ClaI等内切酶购于华美生物有限公司；RNase和T4DNA连接酶购于Promega公司. Trizol试剂及RNA LA PCRTMKit(AMV)购自大连宝生物公司；QiAquick Gel Extraction Kit购于Qiagen公司；质粒提取试剂盒购自Gibco公司.

　　1.2方法

　　1.2.1人膀胱逼尿肌中β2AR全长基因的克隆称取冰冻状态下的膀胱逼尿肌组织约200 mg，采用宝生物公司的Trizol试剂并按使用说明书操作提取总RNA，10 g/L低熔点琼脂糖凝胶鉴定RNA的含量及完整性. 根据Genebank提供的β3AR基因序列（NM_000024）采用Oligo6.6软件设计如下两对引物，外引物及内引物，应用套式PCR来扩增目的基因.
  
　　内引物：上游引物F01： 5′CCGGATC CATCGATATGGGGCAACCCGGGAACGG3′, 下游引物R01： 5′AGGAAGCTTTTACAGCAGTGAGTCATTTG3′;    外引物：上游引物F02： 5′TGCGCTTACCTGCCAGACTG3′,            下游引物R02： 5′GCCCTTCCTTCTGCATATCTC3′.
　　
　　其中内引物是针对蛋白质编码区（CDS:220~1461 bp）设计的，其上游加有BamHI及ClaI酶切位点，下游加有HindIII位点，使其能反向连接在pLNCX的多克隆位点上. 外引物F02，R02可扩增βAR cDNA第194~1587 bp. 引物由大连宝生物公司合成. 取总RNA 1 μL采用宝生物公司的RNA LA PCRTM Kit(AMV)试剂盒进行RTPCR反应. 取8 μL扩增产物用1%琼脂糖凝胶跑电泳，并用BIORAD Flus凝胶图像处理系统进行图像分析.

　　1.2.2β2AR基因反义真核表达载体的构建PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶跑电泳除杂质，并用柱式PCR产物回收试剂盒回收. 回收产物与pUC18克隆载体分别用BamHI和HindIII酶切后在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜连接. 取连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，涂布含有氨苄青霉素、IPIG和Xgal的平板，37℃过夜培养，挑取白色菌落并作标记，通过菌落PCR鉴定阳性重组克隆. 将含有阳性重组质粒的菌落挑入适量LB培养液中，37℃培养过夜，采用Gibco公司的质粒提取试剂盒制备质粒，一部分作BamHI+HindIII双酶切鉴定正确后将其命名为pUCβ3AR；一部分用ClaI+HindIII双酶切后，10 g/L琼脂糖凝胶回收1.2 kb目的基因；随后用ClaI+HindIII双酶切逆转录病毒载体plncx，并用Qiagen公司的QiAquick Gel Extraction Kit后回收plncx经酶切后所产生的载体片段，经T4DNA连接酶连接目的基因及载体片段（16℃水浴过夜连接），摇菌扩增，提取质粒后，用ClaI+HindIII双酶切进行电泳鉴定. 插入片段的碱基序列及其插入方向采用DNA测序方法进行鉴定（由大连宝生物公司鉴定）. 鉴定正确后将β3AR反义真核表达载体命名为pLNCXβ3AR（图1）.

　　2结果

　　2.1目的基因克隆反转录产物经PCR扩增，10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示RTPCR结果与预期长度一致（1.2 kb，图1）.

　　2.2pLNCXβ3AR反义表达载体的酶切鉴定其结果与理论设计完全相符（图2）.

　　1: dl2000 marker; 2：β3AR; 3: 阴性对照.

　　图1β3AR目的基因产物的RTPCR检测（略）

　　1: dl2000 marker; 2:pLNCXβ3AR; 3:空白对照; 4:λHindIII marker.

　　图2pLNCXβ3AR反义表达载体的酶切鉴定（略）

　　2.3pLNCXβ3AR载体中目的基因的碱基序列及其插入方向测序结果显示我们所克隆进入plncx的目的片段其碱基序列与Genebank所提供的β3AR的碱基序列完全一致，且插入方向完全正确，表明我们已经成功构建了人膀胱逼尿肌肾上腺素能β3受体基因的反义真核表达载体：
　　
　　TGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAG

　　TTCTGTATGAGACCACTCGGATCCCGCAACAACTCT

　　GTTGATCATTCAAGAGATGATCAACAGAGTTGTTGCT（测序）.

　　3讨论

　　反义技术是目前许多领域应用得比较多的一种基因治疗技术，其概念就是应用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些基因的表达［4］. 反义技术一般分三种方法：第一种是应用阳离子脂质体将反义的寡链核苷酸带入细胞内部，与mRNA结合，将其屏蔽掉.