作者：季刚，林艳，王为忠，管文贤，牛卫博

【关键词】  大鼠

　　Role of OX34 in treatment of acute rejection after small bowel transplantation in rats

　　【Abstract】  AIM:   To investigate the therapeutic effect of OX34 against acute rejection after small bowel transplantation (SBT) in rats. METHODS:  A total of 72 rats of  2 inbred lines (SD and Wistar) were randomly divided into 4 groups（A, B, C and D）. Group A (n=18) accepted fictitious operation and was fed with common forage;  Group B (n=18) underwent isostrain SBT and the treatment of postoperation such as routine fluid replacement and antibiotic administration;  Group C (n=18) had anisostrain SBT and the same postoperative treatment as group B;  and Group D（n=18）got the same operation as group C and OX34 was added into the same postoperative treatment as group B. Samples of grafts and peripheral blood were taken from 3, 5 and 7 d after SBT and were detected by pathology and flow cytometer. RESULTS:  The survival time and the positive expression rate of CD2 in peripheral blood of group C were significantly different compared with those of the other 3 groups (P<0.05). Acute rejection developed from mild to severe when the samples were taken form 3, 5, 7 d   after SBT. Part of the grafts from group D suffered from a mild degree of acute rejection 5 and 7 d after SBT, while none of the group A and B showed pathological evidence of acute rejection. CONCLUSION:  OX34 significantly suppresses the acute rejection after SBT in vivo.

　　【Keywords】  intestine, small/transplantation; CD2; OX34; rats

　　【摘要】 目的： 探讨可溶性抗CD2 mAb （OX34）在大鼠小肠移植(SBT)急性排斥反应中的治疗作用.  方法： 将两种近交系大鼠（SD, Wistar）72只随机分为A，B，C，D  4组，A组为对照组（n=18）行虚拟手术，给予普通饲料喂养；B组（n=18）行同系小肠移植(isostrain SBT)，术后常规补液，给予抗生素；C组（n=18）行不同品系小肠移植（anisostrain SBT），术后处理同B组；D组（n=18）行不同品系小肠移植，术后除常规补液、给予抗生素外，同时给予OX34. 各组于术后3， 5， 7 d取材. 行病理学及流式细胞术（FCM）检测.  结果：  手术后C组移植受体存活时间及外周血CD2 阳性T淋巴细胞表达率较其他3组差异有统计学意义（P<0.05）. 移植肠病理学检查均有从轻度至重度急性排斥反应的发生. D组部分受体于术后5， 7 d出现轻度急性排斥反应. A，B组未见明显排斥反应发生.  结论： OX34可有效抑制急性排斥反应的发生.

　　【关键词】小肠/移植；CD2；OX34；大鼠

　　0引言

　　小肠移植是治疗小肠功能缺失综合征最理想的方法，但由于小肠具有人体内最大的淋巴库，作为移植物，供体小肠具有更加强烈的抗原性，是影响移植物存活的主要障碍［1］. 尽管多种细胞参与急性排斥反应，但T淋巴细胞发挥主要作用［2］. Ledbetter等［3］研究显示，T淋巴细胞充分活化除了TCR/ CD3途径传递的刺激信号，还需要一种以上的其他刺激信号，即共刺激信号CD2. 我们采用大鼠小肠移植动物模型,探讨可溶性抗CD2 mAb在预防大鼠小肠移植急性排斥反应中的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　实验动物选用健康、雄性近交系Wistar和SD大鼠72只、balb/c小鼠3只(第四军医大学实验动物中心提供) ,体质量280～ 320 g. 室温下混合饲料饲养1 wk后用于实验. 实验期间照明与黑暗12 h交替. OX34杂交瘤、流式细胞仪均由第四军医大学免疫学教研室提供. 大鼠小肠移植模型参照Wallander等［4］的方法，并加以改进. 供受体术前12 h置于代谢笼中禁食，饲以50 g/L糖盐水. 以氯胺酮80 mg/kg,  ip麻醉. 供体手术: 腹部中线纵形切口入腹后 ,首先行全结肠切除术，于距屈氏韧带 5 cm为近端，取小肠约20 cm. 两端均切断、结扎, 游离肠系膜上静脉、门静脉至肝门处，尽量剥净周围胰腺组织，游离带肠系膜动脉的一段腹主动脉 ,阻断已分离的腹主动脉近心端 ,经肾下腹主动脉行小肠原位灌洗，灌洗液为4℃肝素化乳酸林格液约 5～ 10 mL,于40 cm高度灌洗移植肠段至肠管颜色苍白，同时腹腔内充满冰盐水降温. 灌洗的同时于肝门处离断门静脉, 将5F内径Cuff管套入门静脉，翻转门静脉使其内膜向外翻于套管上，0/6# 丝线结扎固定将移植肠取下放入 4℃乳酸林格液中保存. 受体手术:首先行上腔静脉置管. 取左颈前外侧锁骨上纵行皮肤切口约1 cm，显露颈外静脉，向心插入1～1.5 cm达上腔静脉固定. 在插管过程中持续以1 mL/h速度输注生理盐水，防止导管内凝血及气体进入血管. 麻醉同供体，开腹后游离左肾静脉，切除左肾. 显露左肾动脉下方腹主动脉约1.5 cm,在其上、下方阻断血流，移植肠以冰盐水纱布保护，用0/9# 无损伤缝合线行肠系膜上动脉、腹主动脉端侧吻合；移植肠门静脉与左肾静脉利用5F内径Cuff管行袖套式吻合，结扎固定. 去除阻断动、静脉的显微外科止血夹，即见移植肠肠系膜动脉搏动明显 ,移植肠肠管红润，腹腔内倒入37℃温盐水复温. 移植肠近端关闭、末端于左下腹造口. 受体于开腹前、血管吻合后及关腹后各补含头孢唑啉钠4 g/L的平衡盐液2~3 mL,共6~8 mL. 受体存活超过3 d为技术成功. 参照金伯泉等［5］的方法制备OX34.  SDSPAGE测抗体纯度约95%. 异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗体，用紫外分光光度计测F/P比值（每个蛋白分子上所标记荧光素分子数量），为2.8. F/P=（2.87×A495）/（A280-0.35×A495）. 495 nm为荧光素光谱，280 nm为蛋白质光谱.

　　1.2方法

　　72只大鼠随机分为4组（A，B，C，D）. A组为对照组（n=18）行虚拟手术，给予普通饲料喂养；B组（n=18）行同系小肠移植(SD→SD)，术后前3 d予以氨苄青霉素200 mg/kg, iv, 1/d；C组（n=18）行不同品系小肠移植（SD→Wistar），术后处理同B组；D组（n=18）行不同品系小肠移植（SD→Wistar），信捷职称论文写作发表网，术后前3 d予以氨苄青霉素200 mg/kg, iv, 1/d+OX34 6 mg/kg,iv,1/d［6］. 术后1 d开始自由进食水 ,观察大鼠精神状况、进食情况等.  分别于术后3， 5， 7 d每组各抽取4只大鼠，经腹主动脉采血2 mL，置于肝素抗凝管中，立即行流式细胞仪检测；同时，取出移植肠，甲醛液固定；各组余下大鼠作移植小肠生存时间观察，存活至40 d处死. 取肝素抗凝全血100 μL置12 mm×75 mm专用试管中，加20 μL FITC标记的OX34与全血充分混合，室温、避光染色20 min，加2 mL溶血素作用10 min， 1000 r/min 15 min弃上清，加入500 μL洗液重悬成单细胞悬液；同时，设与OX34相同的Ig亚类的FITC直标无关作为阴性对照. 样品制备好后，行FCM分析. 取移植小肠，用40 g/L中性甲醛固定后修剪为1 cm×1.5 cm大小，脱脂、石蜡包埋、切片，以苏木精伊红染色. 排斥反应程度［6］分为轻、中、重.

　　统计学处理： 数据采用x±s表示，利用SPSS 10.0统计软件，进行方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义.

　　2结果

　　A组（n=6）存活时间不受限制；B组（n=6）受体平均存活时间为(33.3±2.3) d，大鼠术后苏醒较快 ,苏醒后即正常活动；C组（n=6）受体为(7.0±2.1) d，术后精神状况逐日下降，对外界反应迟钝；消瘦明显，产生大量腹水，直至死亡；D组（n=6）受体为(24.0±5.0) d，术后精神好，对刺激反应灵敏. 其中C组与A， B，